16S测序难发高分文章 是技术落后还是思维陈旧？
16S测序看似普通结合传统的培养方式以及Rep-PCR依然可以发高分文章！没有过时的技术，只有陈旧的思维，今天要给大家介绍的就是基于16S测序技术的关于驻留在健康成人肠道中的肠杆菌的新思考，获得了9.493的高分，一起来鉴赏今天的佳作吧！
关于驻留在健康成人肠道中的肠杆菌的新思考
Rethinking gut microbiome residency and the Enterobacteriaceae in healthy human adults
作者：Jonathan N. V. Martinson 、 Nicholas V. Pinkham 、Garrett W. Peters、 Hanbyul Cho、 Jeremy Heng、Mychiel Rauch、 Susan C. Broadaway、 Seth T. Walk
期刊：ISME Journal
时间：2019-4
影响因子：9.493
一、研究背景
不少研究报道过基于序列的方法研究人肠道微生物群落时，总会发现一些长期“驻扎”的微生物分类，并且这些微生物分类基本不丢失。但这结论与微生物克隆在人肠道中会不断更替变化是存在“矛盾”的。作者推测这“矛盾”是因为缺少在群落水平和个体水平对人肠道微生物进行同步鉴定。
基于序列的微生物鉴定可能会由于不同人具有不同的主观意识导致最终得出的结论存在差别，例如16S；而针对微生物全基因组序列的宏基因组结果会受到测序深度影响，也会限制其菌种鉴定的能力。因此在基于序列鉴定的基础上，加上基于培养的鉴定方法，形成相互验证和补充的鉴定系统。
肠杆菌科是人肠道中大量存在的微生物分类，也是目前分类学上分类最多的基因家族，作者对8名健康志愿者进行了为期22个月（从2016年3月-2018年1月，每两周收集一次）的粪便采集，对样本同时进行了基于序列和基于培养的菌种鉴定分析。
二、实验结果
1、16S测序发现参与者肠道中类似的微生物组成
针对8位志愿者共392份粪便样本进行了16S V4区域的测序，对数据进行聚类分析一共得到293个OTU，物种注释结果显示有7个cluster在8位志愿者的样本中都能被检测到，其中2号与4号志愿者的肠道微生物组成相似（图1.a）.通过β多样性分析可知在采样的全过程中，肠道微生物的波动性都较小，尤其是4号和5号志愿者（图1.c），并且作者还计算了β多样性与取样时间的相关性，发现两者之间并且明显相关性。
图1.A:8位志愿者肠道微生物NMDS分析；C:β多样性分析
2、OTU“驻留率”的差别
进入肠道的细菌会跟随肠道蠕动运转而丢失，除非细菌能定殖在肠道并且繁殖。作者根据已公布的健康成年人膳食在肠道的运转时间（0.7-4天），设定细菌要克服3倍的运转时间（设定为14天），才会被认作“驻留细菌”。统计发现，在整个取样时间中，在8位志愿者肠道中出现时间超过一半的微生物分类平均只有55%左右（图2），意味着虽然志愿者肠道中微生物组成随着时间的推移变化较少，但是每个分类的成员可能处于持续波动的状态。
图2. 微生物出现在志愿者肠道的时长占总取样时间的百分比堆叠图（黑色代表瞬时出现）
3、基于培养的方式对肠道肠杆菌科的鉴定
将用于16S测序的相同粪便样本使用MacConkey琼脂平板稀释筛选共32470个可培养的单克隆，其中超过87%的单克隆都被鉴定为肠杆菌科。取部分单克隆进行rep-PCR发现约31%为“驻留”肠杆菌科成员，由于并未对所有单克隆进行rep-PCR分析，因此无法确定真实的驻留比例，但就目前的结果而言，肠杆菌科的大肠杆菌无论从比例还是“驻留时间”来说，都属于优势菌株。作者在从上述数据中选取了部分代表性结果绘制成图，结果可发现，即使是“驻留”菌株也并非一直平稳存在，而是持续波动（图3）。
图3.部分志愿者的菌株“驻留”情况
4、16S测序对物种注释能力的思考
在16S分析结果中只有2个OTU被注释成肠杆菌科，其中只有1个OTU被注释到大肠杆菌属，这与基于培养的鉴定结果有较大的差异。作者提出由于细菌rRNA序列的相似性，只依靠16S rRNA进行物种分类的精确度有限，因此也无法反映出微生物群落中每个成员的真实动态，但是16 S在物种分类上还是有出色的预测能力。
三、结论与亮点
1. 长时间取样和精细的实验工作让文章的信服力大增。
2. 作者对于问题的思考全面并且有大量的实验结果来印证猜想。
3. 16 S测序与单克隆鉴定方法结合，可以作为后续研究微生物群落的新思路，用更严谨的结果得出更有价值的结论。
以上就是基于16S的高分文章解读，希望对你有所帮助，那些说16S难发高分文章的论调，是真的技术过时还是思维陈旧呢？度过史上最长假期之后迎来了开学季，被疫情耽误而拖欠的科研项目进度改还了啊······不用怕，美格基因特地准备了几重好礼为大家的科研进度助力。
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